Искусственная хромосома дрожжей - Yeast artificial chromosome

Эта статья о хромосомах, полученных из дрожжевой ДНК. Для дрожжей, созданных из синтетической ДНК, см. Синтетическая ДНК.

Искусственные хромосомы дрожжей (YAC) генетически модифицированные хромосомы, полученные из ДНК дрожжей, Saccharomyces cerevisiae, который затем лигируется в бактериальную плазмиду. Вставляя большие фрагменты ДНК, размером от 100 до 1000 т.п.н., вставленные последовательности можно клонировать и физически картировать с помощью процесса, называемого ходьбой по хромосомам. Это процесс, который изначально использовался для Проект "Геном человека", однако из-за проблем со стабильностью от YAC отказались для использования Бактериальные искусственные хромосомы (БАХ). Начиная с первоначального исследования Ранкина и др., Струла и др. И Хсайо и др., Изначально хрупкая хромосома была стабилизирована путем открытия необходимых автономно реплицирующаяся последовательность (ARS);[1] уточненный YAC, использующий эти данные, был описан в 1983 г. Murray et al.[2] Основными компонентами YAC являются ARS, центромера и теломеры из С. cerevisiae. Кроме того, для отбора трансформированных дрожжевых клеток используются гены селектируемых маркеров, таких как устойчивость к антибиотикам и видимый маркер. Без этих последовательностей хромосома не будет стабильной во время внеклеточной репликации и не будет отличаться от колоний без вектора.[3]

Это фотография двух копий библиотеки YAC по геному человека Вашингтонского университета. Каждая из стопок составляет примерно 12 микротитровальных пластин. В каждом планшете 96 лунок, каждая с разными клонами дрожжей.

строительство

YAC построен с использованием первоначальной кольцевой ДНК. плазмида, который обычно разрезают на линейную молекулу ДНК, используя рестрикционные ферменты; ДНК-лигаза затем используется для лигирования интересующей последовательности ДНК или гена в линеаризованную ДНК с образованием единого большого кольцевого фрагмента ДНК.[2] Основное поколение линейных искусственных хромосом дрожжей можно разбить на 6 основных этапов:

1. Лигирование селектируемого маркера в плазмидный вектор: это позволяет проводить дифференциальный отбор колоний с маркером геном An или без него. устойчивость к антибиотикам ген позволяет амплифицировать вектор YAC и отбирать его для Кишечная палочка сохраняя способность мутантной E. coli синтезировать лейцин при наличии необходимых компонентов в питательной среде. TRP1 и URA3 гены - другие выбираемые маркеры. Сайт клонирования вектора YAC для чужеродной ДНК расположен внутри SUP4 ген. Этот ген компенсирует мутацию в дрожжевой клетке-хозяине, которая вызывает накопление красного пигмента. Клетки-хозяева обычно красные, а те преобразованный только с YAC образует бесцветные колонии. Клонирование чужеродного фрагмента ДНК в YAC вызывает инсерционную инактивацию гена, восстанавливая красный цвет. Таким образом, колонии, содержащие фрагмент чужеродной ДНК, имеют красный цвет.[4]

2. Лигирование необходимых центромерных последовательностей для митотической стабильности. [5]

3. Лигирование автономно реплицирующихся последовательностей (ARS), обеспечивающее начало репликации для проведения митотической репликации. Это позволяет плазмиде реплицироваться вне хромосом, но делает плазмиду очень митотически нестабильной и легко теряется без центромерных последовательностей.[3][6]

4. Лигирование искусственных теломерных последовательностей для преобразования кольцевой плазмиды в линейный фрагмент ДНК. [7]

5. Вставка последовательности ДНК для амплификации (до 1000 КБ)

6. Трансформация дрожжевой колонии[8]

Полная хромосома III

В марте 2014 г. Джеф Боке из Медицинского центра Лангоне при Нью-Йоркском университете, опубликовал, что его команда синтезировала один из С. cerevisiae 16 дрожжевых хромосом, хромосома III, которую он назвал synIII.[9][10] Процедура включала замену генов в исходной хромосоме синтетическими версиями, а готовая синтезированная хромосома затем была интегрирована в дрожжевую клетку. Это потребовало разработки и создания 273 871 пары оснований ДНК - меньше, чем 316 667 пар в исходной хромосоме.

Использование в биотехнологии

Векторы экспрессии дрожжей, такие как YAC, YIps (дрожжевые интегрирующие плазмиды) и Да (дрожжевые эписомальные плазмиды) имеют преимущество перед бактериальные искусственные хромосомы (ВАС) в том смысле, что они могут использоваться для экспрессии эукариотических белков, требующих посттрансляционная модификация. Имея возможность вставлять большие фрагменты ДНК, YAC можно использовать для клонирования и сборки полных геномов организма.[11] После встраивания YAC в дрожжевые клетки они могут быть размножены как линейные искусственные хромосомы, клонируя при этом встроенные участки ДНК. После этого можно использовать два процесса для получения секвенированного генома или интересующей области:

1. Физическое отображение

2. Хромосомная ходьба[12]

Это важно тем, что позволяет детально картировать определенные области генома. Были исследованы целые хромосомы человека, такие как Х-хромосома,[13] определение местоположения генетических маркеров для множества генетических нарушений и признаков.[14]

Схема плазмиды pBR322, созданной в лаборатории Бойера в Калифорнийском университете в Сан-Франциско Боливаром и Родригесом в 1972 году. Это один из первых и наиболее широко используемых векторов и основа для YAC, созданных Мюрреем и Шостаком в 1983 году. Плазмида содержит ампициллин. и гены устойчивости к тетрациклину, и набор сайтов-мишеней рестрикционных ферментов для встраивания фрагментов ДНК.

Проект "Геном человека"

YAC значительно менее стабильны, чем BAC, вызывая «химерные эффекты»: артефакты, в которых последовательность клонированной ДНК фактически соответствует не одной области генома, а нескольким областям. Химеризм может быть следствием либо совместной лигирования нескольких геномных сегментов в один YAC, либо рекомбинации двух или более YAC, трансформированных в одной и той же клетке дрожжей-хозяев.[15] Заболеваемость химеризмом может достигать 50%.[16] Другие артефакты - это удаление сегментов из клонированной области и перестройка геномных сегментов (например, инверсия). Во всех этих случаях последовательность, определенная по клону YAC, отличается от исходной естественной последовательности, что приводит к противоречивым результатам и ошибкам в интерпретации, если полагаться на информацию о клоне. Из-за этих проблем Проект "Геном человека" в конечном итоге отказался от использования YAC и перешел на бактериальные искусственные хромосомы, где частота появления этих артефактов очень мала. Помимо проблем со стабильностью, в частности, относительно частого возникновения химерных событий, YAC оказались неэффективными при создании минимального тайлинг-пути, охватывающего весь геном человека. Создание библиотек клонов занимает много времени. Кроме того, из-за характера зависимости от сайты, помеченные последовательностью (STS) в качестве ориентира при выборе подходящих клонов существуют большие пробелы, которые требуют дальнейшего создания библиотек для расширения. Именно это дополнительное препятствие побудило проект использовать вместо этого BAC.[17] Это связано с двумя факторами:[18]

1) BAC создаются намного быстрее, и при создании избыточных библиотек клонов это важно.

2) BAC обеспечивают более плотное покрытие с помощью STS, в результате чего создаются более полные и эффективные пути с минимальной мозаикой, генерируемые in silico.

Однако можно использовать оба подхода, как было продемонстрировано, когда геном нематоды C. elegans. Там большая часть генома была покрыта BAC, а пробелы заполнены YAC.[17]

Смотрите также

использованная литература

  1. ^ Сяо К.Л., Карбон Дж. (Август 1979 г.). «Высокочастотная трансформация дрожжей плазмидами, содержащими клонированный дрожжевой ген ARG4». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 76 (8): 3829–33. Bibcode:1979PNAS ... 76.3829H. Дои:10.1073 / pnas.76.8.3829. ЧВК  383928. PMID  386351.
  2. ^ а б Мюррей А. В., Шостак Дж. В. (1983). «Создание искусственных хромосом у дрожжей». Природа. 305 (5931): 189–93. Bibcode:1983Натура.305..189М. Дои:10.1038 / 305189a0. PMID  6350893.
  3. ^ а б Рацкин Б., Углерод Дж. (Февраль 1977 г.). «Функциональная экспрессия клонированной дрожжевой ДНК в Escherichia coli». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 74 (2): 487–91. Bibcode:1977ПНАС ... 74..487Р. Дои:10.1073 / пнас.74.2.487. ЧВК  392314. PMID  322128.
  4. ^ Страчан Т. (2011). Молекулярная генетика человека / Том Страчан и Эндрю Рид, 4-е изд.
  5. ^ Кларк Л., Карбон Дж. (Октябрь 1980 г.). «Выделение центромеры дрожжей и построение функциональных малых кольцевых хромосом». Природа. 287 (5782): 504–9. Bibcode:1980Натура.287..504C. Дои:10.1038 / 287504a0. PMID  6999364.
  6. ^ Struhl K, Stinchcomb DT, Scherer S, Davis RW (март 1979 г.). «Высокочастотная трансформация дрожжей: автономная репликация гибридных молекул ДНК». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 76 (3): 1035–9. Bibcode:1979ПНАС ... 76.1035С. Дои:10.1073 / pnas.76.3.1035. ЧВК  383183. PMID  375221.
  7. ^ Поцелуй ГБ, Амин А.А., Перлман Р.Э. (июнь 1981 г.). «Две отдельные области внехромосомной рибосомной дезоксирибонуклеиновой кислоты Tetrahymena thermophila обеспечивают автономную репликацию плазмид в Saccharomyces cerevisiae». Молекулярная и клеточная биология. 1 (6): 535–43. Дои:10.1128 / mcb.1.6.535. ЧВК  369696. PMID  6765606.
  8. ^ Берк Д.Т., Карл Г.Ф., Олсон М.В. (май 1987 г.). «Клонирование больших сегментов экзогенной ДНК в дрожжи с помощью искусственных хромосомных векторов». Наука. 236 (4803): 806–12. Bibcode:1987Научный ... 236..806Б. Дои:10.1126 / наука.3033825. PMID  3033825.
  9. ^ Шукман, Давид (27 марта 2014 г.). «Ученые приветствуют развитие синтетических хромосом». Новости BBC. Получено 2014-03-28.
  10. ^ 24674868Annaluru N, Muller H, Mitchell LA, Ramalingam S, Stracquadanio G, Richardson SM и др. (Апрель 2014 г.). «Полный синтез функционального конструктора эукариотической хромосомы». Наука. 344 (6179): 55–8. Bibcode:2014Наука ... 344 ... 55А. Дои:10.1126 / science.1249252. ЧВК  4033833. PMID  24674868.
  11. ^ Берк Д., Карл Г. и Олсон М. Клонирование больших сегментов экзогенной ДНК в дрожжи с помощью искусственных хромосомных векторов. Science 236, 806–812 (1987).
  12. ^ Kere, J .; Nagaraja, R .; Mumm, S .; Ciccodicola, A .; Д'Урсо, М. (1992). «Картирование человеческих хромосом путем хождения с сайтами с метками последовательности из концевых фрагментов вставок искусственных хромосом дрожжей». Геномика. 14 (2): 241–248. Дои:10.1016 / s0888-7543 (05) 80212-5. PMID  1427839.
  13. ^ Росс, М. Т .; и другие. (2005). «Последовательность ДНК Х-хромосомы человека». Природа. 434 (7031): 325–337. Bibcode:2005Натура.434..325р. Дои:10.1038 / природа03440. ЧВК  2665286. PMID  15772651.
  14. ^ Петрухин К., Фишер С.Г., Пирасту М., Танзи Р.Э., Чернов И., Девото М., Бжустович Л.М., Каянис Е., Витале Е., Руссо Дж. Дж. (Декабрь 1993 г.). «Картирование, клонирование и генетическая характеристика области, содержащей ген болезни Вильсона». Природа Генетика. 5 (4): 338–43. Дои:10.1038 / ng1293-338. PMID  8298640.
  15. ^ Халди М., Перро В., Сомье М., Десаи Т., Коэн Д., Шериф Д., Уорд Д., Лендер Е.С. (декабрь 1994 г.). «Большие человеческие YAC, сконструированные на основе штамма rad52, демонстрируют пониженную скорость химеризма». Геномика. 24 (3): 478–84. Дои:10.1006 / geno.1994.1656. PMID  7713499.
  16. ^ Бронсон С.К., Пей Дж., Тайлон-Миллер П., Чорни М.Дж., Джерати Д.Е., Чаплин Д.Д. (март 1991 г.). «Выделение и характеристика клонов искусственных хромосом дрожжей, связывающих локусы HLA-B и HLA-C». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 88 (5): 1676–80. Bibcode:1991PNAS ... 88.1676B. Дои:10.1073 / pnas.88.5.1676. ЧВК  51087. PMID  2000377.
  17. ^ а б Роуэн, Л., Махайрас, Г. и Худ, Л. Секвенирование генома человека. Наука (1997).
  18. ^ Макферсон Дж. Д., Марра М., Хиллиер Л., Уотерстон Р. Х., Чинвалла А., Уоллис Дж. И др. (Февраль 2001 г.). «Физическая карта генома человека». Природа. 409 (6822): 934–41. Bibcode:2001Натура.409..934М. Дои:10.1038/35057157. PMID  11237014.

внешняя ссылка